唐天宝十二年（公元753年）十月十五日，日本第10次遣唐使归国前夕，遣唐大使藤原清河、副使吉备真备、大伴古麻吕和仕唐多年、历任唐光禄大夫、御史中丞、秘书监等职的日本留学生阿倍仲麻吕（汉名晁衡）等也准备回国，他们同到扬州延光寺参谒鉴真。藤原大使说：“早闻大和尚曾五次东渡日本欲去传教，今日得见，万分荣幸，若大和尚仍有此愿，弟子等有船四艘返日，应用物品俱备，不知肯同行否？”鉴真虽已66岁高龄，且双目失明，但为了传教授戒，为了中日人民的友好及文化交流，便应允了日方恳请。
鉴真欲再度赴日的消息在扬州传开后，有关寺院为阻挠此行，严密防范。这时正好鉴真弟子仁干从婺州（今浙江金华市）来扬州，密知师父将要远行，遂暗中约定由他备船在江头接候。10月29日晚，鉴真及弟子工匠等24人从扬州龙兴寺潜行至江头，迅即登船启程，出大运河入长江，直趋苏州黄泗浦（今江苏省常熟县黄泗，即黄歇浦）与日本遣唐使船队会合。鉴真带去的物品有如来、观世音等佛像8尊，舍利子、菩提子等佛具7种、华严经等佛经84部300多卷，还有王羲之、王献之真迹行书等字帖三种。
临行前，恐官府发觉，经卷有失，于11月15日鉴真一行分乘第二、三、四船。直到11月16日船队启航前鉴真才上了大伴古麻吕的第二船。驶入东海后，船队被强劲的东北风吹散，第四船杳无踪影，剩下的三只船只有奋力拚搏向前航行。11月21日，第一、二两船同到冲绳岛，已在多弥岛（今日本种子岛）的西南。第三船昨夜已停泊在同处。12月6日，海上刮起人们渴望的南风，三只船相继起航顺风前进，而藤原大使与阿倍仲麻吕所乘的第一船触礁无法行动。鉴真所乘的第二船发向多弥去，7日到达益救岛（今日本屋久岛）。停泊候风10天，并等待其余船只。第一船修复后，继续航行，因遇偏北风暴而漂至安南州（今越南境内），全船180余人，死难170多人，仅大使藤原清河与阿倍仲麻吕等10余人幸免于难。第三船后来也航返日本。12月18日，第二船自益救岛出发续航，19日遇到暴风雨，不辨东南西北，鉴真等又历经磨难，于12月20日中午抵达日本九州萨摩国阿多郡秋妻屋浦（今日本鹿儿岛县）。12月26日，鉴真等一行在日僧延庆的引导下进入日本太宰府，并于次年（公元754年）2月1日，航达日本遣唐使船队的始发港难波（今日本大阪附近）。2月4日鉴真到达日本首都奈良，受到日本举国上下盛大的欢迎，皇族、贵族、僧侣都来拜见。
3月，吉备真备以敕使身份向鉴真宣读了天皇的诏书：“大和尚远涉沧波，来到我国，朕不胜欣慰，自今以后，授戒传律都由大和尚担任。”4月初，在东大寺设戒坛，由鉴真登坛主持，先后为太上皇圣武天皇、皇太后、皇子及400余位僧人授戒。756年，孝谦天皇任命鉴真为大僧都，统理日本僧佛事务。758年卸任，被尊称为“大和上”，恭敬供养。759年，鉴真率弟子仿扬州大明寺格局设计修建了唐招提寺，至今仍存，被视为日本国宝，对日本建筑艺术有重要影响。以后，鉴真在此授戒讲经，把律宗传至日本，成为日本律宗的始祖。鉴真虽双目失明，但能凭记忆校对佛经。他还精通医学，凭嗅觉辨草药，为人治病。留下一卷《鉴上人秘示》的医书，对日本医药学的发展作出了贡献。他带到日本的中国佛经印刷品和书法碑帖对日本的印刷术、书法艺术有很大影响。
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